医防融合工作流程图（17篇）

医防融合工作流程图（17篇）医防融合工作流程图　　**社区卫生服务站文件　　**社字〔2021〕13号　　**社区卫生服务站与二级以上医院开展双向转诊制度的实施方案　　实施双向转诊制下面是小编为大家整理的医防融合工作流程图（17篇）,供大家参考。

篇一：医防融合工作流程图

　　**社区卫生服务站文件

　　**社字〔2021〕13号

　　**社区卫生服务站与二级以上医院开展双向转诊制度的实施方案

　　实施双向转诊制度是为辖区居民提供方便、快捷、连续性医疗服务的最佳手段。与二级以上医院、医生形成分工协作的关系，建立有效的联动机制，是落实双向转诊的基础，为规范双向转诊流程，确保制度有序运转，现制定双向转诊实施方案。

　　一、转诊原则：1、患者自愿的原则：从维护病人利益出发，充分尊重患者以及家属亲属的选择权，切实当好患者的参谋；2、分级诊治的原则：一般小病、常见病常规诊治在社区，危急重难症诊治在上级医院，一般康复或临终关怀在社区；3、就近转诊的原则：根据病人病情和医疗机构服务可及性，

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　　就近转诊病人，做到方便、快捷；4、针对性和有效性原则：根据患者的病情及意愿，有选择

　　地将病人转诊至专科、专病特色的医疗机构，提高诊治的有效性；

　　5、资源共享的原则：做到检查结果通用，不做不必要的重复检查，降低病人的费用；

　　6、连续管理的原则：建立起有效、严密、实用、畅通的上下转诊渠道，为病人提供整体性、持续性的医疗服务。

　　二、工作目标进一步提升二级以上医院与基层医疗卫生机构分工合理、服务规范、分级诊疗、双向转诊、急慢分治、运转有效的新型医疗服务管理机制，引导一般常见病、慢性病、康复等患者下沉到基层医疗卫生机构，努力实现大病不出区，县域内就诊率提高到90%以上。三、职责分工（一）社区卫生服务机构1、社区医生要熟悉转诊医院的基本情况、专家特长、常用检查项目及价格，协助或指导病人选择合适的专家和检查项目，及时将符合转诊条件的患者转往上级医院，避免患者盲目选择和减少医疗开支；2、社区卫生服务机构上转病人时填写《双向转诊单》，注明初步诊断、患者的病史及诊治情况、转诊原因等情况，由经

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　　治医师签字并加盖公章；3、危急重症患者上转时，需派专人护送并向接诊医生说明

　　病人病情，同时提供相关的检查、治疗资料；4、遇有职业病、精神障碍性疾病患者应及时上转至相应的

　　专科医疗机构或有相应专业的综合医院；5、遇有传染病，要严格按照《中华人民共和国传染病防治

　　法》规定，将各类传染病人转至传染病定点收治医院、结核病防治所，并按规定上报疫情；

　　6、对上级医院转回社区进行后续及时治疗康复的患者，做好相关衔接工作，对转回的患者诊治信息情况及时记录在档案里，实行健康档案动态管理和信息化管理。

　　（二）二级以上医疗机构1、应成立双向转诊服务部，制定双向转诊实施方案，指定专人负责双向转诊工作，设立专线电话，实行24小时连续服务，建立双向转诊绿色通道，明确服务流程，确保服务质量；2、对社区转来的病人要认真进行登记，并及时安排专人将患者送至病区或门诊，对转入病人提供预约门诊检查、组织会诊及协调处理住院事宜等服务；3、对社区转来的住院患者除免收挂号费外，实行优先就诊、检查、交费、取药，优先安排住院治疗；4、要定期派出专家到签定“转诊协议”的社区卫生服务机构出诊，协助社区处理疑难病症，免费开展健康教育、保健咨

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　　询，义务对社区医生进行培训。5、要将本单位简况、特色、知名专家特长、大型设备拥有

　　情况及优惠待遇编印成册，发至社区医生手中，方便社区医生转诊。

　　6、积极为社区卫生服务机构提供技术支持，帮助解决技术难题，有些检验项目，社区不能开展，患者前往医院又有困难的，社区可按要求留取标本，并及时送往上级医院进行检验，上级医院检验结果可通过电脑或网络手段及时反馈给社区。

　　7、对社区转来的患者根据病情合理检查，不作不必要的重复检查。

　　8、将康复期、诊断明确且病情稳定的慢性病等符合下转条件的患者应及时转回社区，填写《双向转诊下转单》，向社区卫生服务机构提供患者治疗评估和诊断、预后、辅助检查及转回社区后续的治疗、康复方案、诊治医生签名、联系方式等材料，提供后续治疗和康复的业务指导以及必要的跟踪服务。

　　二、双向转诊指征1、上转指征

　　（1）涉及医疗服务内容超出核准登记的诊疗科目范围。（2）不具备相关医疗技术临床应用资质。（3）各种临床急危重症或慢性病病情控制不满意，经团队内或机构内会诊调整治疗方案后，效果仍欠佳，家庭医生判断符合转诊指征者。

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　　（4）对诊断有疑问，需要二级以上医院的技术支持协助。（5）依据有关法律法规，需转入专业防治机构治疗。（6）卫生行政部门规定的其他情况。2、下转指征（1）常见病、多发病以及慢性病的稳定阶段。（2）诊断明确的患者，经处理后病情稳定，需要家庭医生团队的长期管理。（3）各类手术后病情稳定，符合社区康复治疗条件的。（4）各种疾病晚期仅需保守、支持、姑息治疗的患者。（5）市、县卫生行政部门规定的其他情况。三、双向转诊流程图

　　**社区卫生服务站

　　符合上转指征的患者

　　向患者解释其病情，并给与上转建议

　　患者同意转诊二级以上医院

　　家庭医生与二级以上医院的专科医生点对点的联系，进行病情交流以及确认转诊方式（门诊或住院）。

　　定期针对上／下转病人的信息互通交流

　　整理及准备好患者的健康信息，包括检查结果，诊断，用药方案，以及进一步治疗方案，与家庭医生之间进行资料交接。并对专科疾病治疗及注意事项方面的给予指导、相互交流。

　　专科医生与家庭医生点对点的联系，进行病情交流以及确认

　　转诊方式（门诊或住院）。

　　经患者同意转诊基层医疗卫生机构

　　整理及准备好患者的健康信息，包括患病情况，就诊记录及检查结果，用药情况等，与专科医生之间进行资料交接。

　　符合下转指征的患者

　　二级以上医院

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　　四、工作要求1、分工明确，责任到人。各级医疗机构要严格按照《国家基本公共卫生服务规范

　　（2017年山东）》的要求，将任务落实至具体岗位，责任到人。

　　2、转变思想观念，落实医防融合。各级家医团队要灵活掌握公共卫生服务项目中各模块的服务流程，坚持基本医疗和公共卫生服务并重，做实医防融合，切实把各项公共卫生服务落实到位。3、强化流程，注重实施效果。严格按照规范规定内容、流程、要求提供服务。对转诊居民的随访时间、次数、服务内容、检查项目等必须符合规范要求，确保达到双向转诊的目的和效果，真正做到让群众满意，提高居民的获得感。附件：社区卫生服务双向转诊协议书

　　**社区卫生服务站2021年1月3日

　　主题词：家庭医生签约服务实施方案报送：**社区卫生服务中心社区管理科印发单位：**社区卫生服务站印发日期：2021年1月3日

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篇二：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1９75年,Kohlｅr和Mｉｌstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一)免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McＡb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×107/0。5ｍlip（腹腔内注射)

　　↓２~3周后

　　第二次免疫

　　1×1０７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天)1×107/0。5mｌip或iｖ(静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2。可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Aｇ1~５0μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

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　　│（一般0.8~1ｍｌ0．２ml/点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或iｐ

　　│

　　（ip剂量不宜超过0。5mｌ)

　　↓３周后

　　第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip

　　│（5～７天后采血测其效价,检测免疫效果）

　　↓2~3周后

　　加强免疫，剂量50~500μg为宜，ｉp或ｉv

　　↓３天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　（二)饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T３经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLｂ/c小鼠6～10周龄

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　　拉颈处死浸泡于75％酒精,消毒3～5分钟

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　　用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜

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　　用无菌注射器注入6~8ml培养液

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　　反复冲洗,吸出冲洗液

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　　放入10ml离心管,12０0转／分离心5~6分钟

　　↓

　　用20%小牛血清(ＮCＳ)或胎牛血清(ＦCS)的培养液混悬,调整细胞数1×10５／ml

　　↓

　　加入96孔板,１00μl／孔

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　　放入３7℃CO2孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～８×１０6腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞(3T3）1×1０5／mｌ，均为1００μl／孔.

　　（三)骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量MｃAb．

　　常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2／０、X63Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，ＤＭEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～２0%，细胞的最大密度不得超1０６／ｍl,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每３～5天传代一次.细胞的倍增时间为16~２0小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞.

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　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAＴ的敏感性,每3～６月应用8~ＡＧ(８氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态，活细胞计数高于95％,也是决定细胞融合的关键。

　　（四)免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

　　脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数.一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍,细胞数为２×108左右。

　　二、细胞融合,选择杂交瘤

　　（一）细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞ＳP2/0，1０0０rpｍ离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤２次.

　　(2)同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2次．

　　（3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或１∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗１次，1２00rｐm,8分钟.

　　(4)弃上清，用滴管吸净残留液体,以免影响ＰＥG的浓度。

　　（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　(６)在室温下融合:

　　①30秒内加入预热的1ml４5%ＰEG(Ｍerek，分子量400０）含5%DMSO，边加边搅拌。

　　②作用９0秒钟,若冬天室温较低时可延长至１20秒钟。

　　③加预热的不完全培养液，终止PＥG作用,每隔２分钟分别加入1ml，2ml,3mｌ，4ml,５ml和10ml。

　　（7）离心，800rｐｍ，６分钟。

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　　（８）弃上清，先用６ｍl左右20%小牛血清ＲPMI1６40轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开.

　　(９)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10ml一块96孔板.

　　(10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,１０0μl／孔，３７℃、5%ＣO2孵箱培养。

　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞。

　　(二)HAT选择杂交瘤

　　应用HAＴ选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后,加HＡT选择培养液。HT和HAＴ均有商品化试剂５0×贮存，用时1ml加入50ｍｌ2０％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的ＨAＴ。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／３进行选择,可得到满意的筛选结果。

　　５０×ＨAＴ

　　Ｈ:5×10—3M

　　A:2×10-５M

　　T:8×1０—4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

　　三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系．

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:

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　　1。ELIＳA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2。RＩA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测.

　　3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAｂ检测．

　　4。ＩＦＡ用于细胞和病毒ＭcAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机.

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存

　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚ｒ为经过ＨAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力.

　　(一）克隆化方案

　　用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1。有限稀释法的程序

　　①制备饲养细胞悬液(同融合前准备）

　　②阳性孔细胞的计数,并调细胞数在１～5×103/ｍl

　　③取13０个细胞放入６。5ml含饲养细胞完全培养液，即2０个细胞／ml,100μl/孔加A、Ｂ、C三排为每孔2个细胞。余下2．９ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ｍｌ,1００μl/孔加Ｄ、Ｅ、F三排，为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加２.2ｍｌ含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个／ml,100μl／孔,加Ｇ、H两排,为每孔0。5个细胞。

　　④培养4~５天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。

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　　⑤第８~9天时，肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。

　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HＴ。

　　2。软琼脂法

　　①软琼脂的配制

　　含20％FCS(小牛血清)的２倍浓缩的RＰMI1640

　　1％琼脂水溶液:高压灭菌,４2℃预热。

　　0.５%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的２倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　②用上述０.5％琼脂液（含有饲养细胞)１５mｌ倾注于直径为9ｃm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用.

　　③按100/ml，５00/ml或5000／mｌ等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　④1ml0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与１ml不同浓度的细胞悬液相混合.

　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中1０分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%ＣO２孵箱中。

　　⑥４~５天后即可见针尖大小白色克隆，7~１０天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体，扩大培养,必要时再克隆化。

　　（二）杂交瘤细胞的冻存

　　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的.因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃.

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×1０6以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液:

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　　５0％小牛血清

　　40％不完全培养液

　　１0%DMＳO（二甲亚砜)

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速.冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱,次日转入液氮中.也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间.

　　五、单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

　　１。体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为1０~60μg／mｌ,如果大量生产，费用较高.

　　2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～３×107/mｌ接种于小鼠背部皮下,每处注射０.2ｍl，共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般1０~20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/ｍｌ。但采血量有限。

　　②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPｒiｓｔａnｅ(降植烷)或液体石腊于BaＬb/c鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞７~１0天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1~1０ml腹水.也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达５-２0mg／ml,这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

　　六、单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McＡb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：

　　１。抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的MｃAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其它细胞因子间有无交叉。

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　　2.McＡｂ的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgＧ或IｇM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgＭ类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELIＳA来确定McAｂ的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG（3％），将有利于沉淀线的形成。

　　3．ＭcAb中和活性的鉴定:用动物的或细胞的保护实验来确定ＭcAｂ的生物学活性。例如如果确定抗病毒ＭcＡb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　４.ＭcAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合试验、测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RＩA竞争结合试验来确定McＡｂ与相应抗原结合的亲和力。

　　七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备MｃAb的实验周期长,环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:

　　１.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题．一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清,此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理．对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时,犖＾菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

　　2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEＧ有毒性或作用时间过长.②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAＴ有问题,主要是Ａ含量过高或ＨT含量不足。

　　3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①融合后有细胞生长，但无抗体产生,可能是ＨAT中Ａ失效或骨髓瘤细胞发生突变,变成A抵抗细胞所致.

　　②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

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　　③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性,可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

　　要定期进行再克隆。

　　三不要：

　　不要让细胞“过度生长＂。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞.

　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　4．杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染,使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加ＨT。

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篇三：医防融合工作流程图

　　***社区卫生服务中心2019年医防融合工作总结

　　自医防融合试点工作开展以来，我中心根据上级主管部门相关部署及任务目标要求，依托紧密型医联体内资源优势，优化医防融合服务细节，积极探索医防融合服务模式，取得了一定成果，培养了一批服务队伍，也发现了一些不足，现汇报如下：

　　一、医防融合总体工作指标提升截至2019年11月底，在管高血压、糖尿病病人就诊率分别提升至**%、**%，门诊就诊的高血压、糖尿病病人管理率提升至**%、**%；二、医防融合运作模式有效探索我中心与**医院构建了紧密型医联体，每周有内分泌科等科室专家定期在中心坐诊，依托此优势资源，将**作为医疗服务主体和医疗技术支撑，我中心作为持续管理者协调患者饮食、运动行为规范和就诊途径。三、慢病高危人群筛查力度加大由于我中心服务区域居民区拆迁较多，且暂无还建，服务人群大规模减。在此基础上，我中心采取精兵策略，深挖现有服务区域，精准筛选慢病高危人群，对慢病患者早发现、早治疗，提升患者预期生活质量，并结合现代化信息手段和健康武汉App家庭医生签约服务，完善高危人群数据库，为提高管理率和规范管理率做好基础保障。

　　四、医防融合核心竞争力提高核心竞争力的提高离不开优秀的人才队伍培养、扎实的基础设施建设和合理的绩效分配，试点工作开展以来，我中心共引进一批预防医学、临床医学、护理等相关专业人员，充实了医防融合管理队伍，同时选派骨干成员参加各级医疗主管部门或医疗卫生机构组织的慢病管理培训；扩充了中心慢性病用药目录，结合公共卫生管理系统和中心HIS系统等信息化手段，搭建慢病管理团队与药品采购部门沟通平台，根据患者用药需求及时提供药品供应。五、目前存在的不足（一）慢病管理能力仍需提升，目前慢病发病趋势朝着年轻化、并发症多样化发展，管理难度进一步提升，对我们基层医疗卫生机构的管理提出了很大挑战，我中心医防融合管理团队在这些方面缺乏相应的技术储备，需要在今后继续学习，补齐短板。（二）绩效分配手段激励性不够目前我中心绩效正在准备新一轮的绩效分配制度改革，但是总体框架仍在传统的公共卫生服务和全科医疗范围内单独进行，需要在新的绩效分配方案实施后，根据中心职工工作情况反馈，针对医防融合工作做出专项激励措施。

　　**社区卫生服务中心2019年12月17日

　　附：医防融合工作流程图

　　辖区服务人群

　　全科门诊筛查

　　健康讲座，社区巡诊筛查

　　慢病确诊人群慢病管理

　　无效

　　生理指标正常

　　生理指标异常管理团队反馈至全科门

　　诊或医联体专家制定个体化治疗方案

　　生理指标异常

　　转诊至上级医联体单位

　　慢病高危人群健康管理有效健康人群

篇四：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

　　单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

　　新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具.

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　（一)免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要.一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天)1×10７／0。5mlip或iv(静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂,福氏不

　　完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一滴

　　在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂

　　在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│（一般0。8～1ml0。2ml／点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip

　　│(5～7天后采血测其效价,检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新,

　　如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可

　　降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③

　　使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　（二)饲养细胞

　　资料整理

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　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞,如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏.

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3~5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6~8ml培养液

　　↓反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管,1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml,小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞(3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8.653等.骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％,细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞.一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。(四）免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

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　　脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一）细胞融合流程

　　（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5）轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。（6）在室温下融合:①30秒内加入预热的1ml45%PEG（Merek，分子量4000）含5%DMSO，边加边搅拌.②作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟.③加预热的不完全培养液,终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml,2ml，3ml,4ml,5ml和10ml。(7）离心，800rpm，6分钟。（8）弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开.（9)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液，10ml一块96孔板.(10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔,37℃、5％CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。（二)HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度.一般在融合24小时后，加HAT选择培养液.HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中.因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择,可得到满意的筛选结果。50×HATH:5×10—3MA：2×10-5MT：8×10—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法，

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　　一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则.常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测.2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3.FACS（荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机.

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤

　　克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体（特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化.克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失.即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

　　(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1.有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备)②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2。9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml,100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞.余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml,100μl／孔,加G、H两排，为每孔0.5个细胞。④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl／孔.⑤第8~9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT.2。软琼脂法①软琼脂的配制含20%FCS（小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。0.5％琼脂:由1份1%琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。②用上述0。5%琼脂液（含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④1ml0。5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育

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　　于37℃，5%CO2孵箱中。⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后,直接移种至含饲养细

　　胞的24孔板中进行培养。⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。（二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的.

　　因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等.如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃.

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养,当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿.

　　细胞冻存液：50%小牛血清40%不完全培养液10%DMSO（二甲亚砜)冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中.或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产,费用较高。2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml,共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限.②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉.

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　　2.McAb的Ig类与亚类的鉴定:一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类.在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3％）,将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4。McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同.

　　5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长,环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题.一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。2。融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题,主要是A含量过高或HT含量不足。3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长，但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致.②有可能是免疫原抗原性弱,免疫效果不好.③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失.Goding91982）曾提出“三要"“三不要",可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”.因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月.不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

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　　4.杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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篇五：医防融合工作流程图

　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

　　单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

　　新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法.

　　一、细胞融合前准备

　　（一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip（腹腔内注

　　射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0.5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天）1×10７／0.5mlip或iv（静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏

　　不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一滴

　　在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂

　　在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀.

　　初次免疫Ag1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│(一般0。8～1ml0。2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　(ip剂量不宜超过0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

　　│（5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如

　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降

　　低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射.③使

　　用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性.

　　（二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛

　　选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75%酒精，消毒3～5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　↓反复冲洗,吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20％小牛血清（NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5~8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml,小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%,细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞.一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。（四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例

　　较大，融合的成功率较高.脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次，置

　　平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数.一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍,细胞数为２×10８左右。二、细胞融合，选择杂交瘤(一)细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟,弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次.(3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟.(4）弃上清,用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度.（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6）在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5%DMSO,边加边搅拌.②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。③加预热的不完全培养液,终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml,2ml，3ml，4ml，5ml和10ml.(7）离心,800rpm，6分钟。（8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。（10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5%CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。(二)HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度.一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中.因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。50×HATH:5×10-3MA：2×10-5MT:8×10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液.三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有：1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3。FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程.可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞.要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。（一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备)②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1~5×10３／ml③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml,100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2。9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞.余下2.2ml细胞悬液补加2。2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔,加G、H两排，为每孔0。5个细胞.④培养4～5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。②用上述0。5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④1ml0。5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.

　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　　⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养.

　　⑦检测抗体，扩大培养,必要时再克隆化。（二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液：50％小牛血清40％不完全培养液10％DMSO(二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2～3℃,待降至—70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中.也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1。体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10～60μg／ml,如果大量生产，费用较高。2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2～4点.待肿瘤达到一定大小后(一般10~20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前，处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1~10ml腹水.也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml,这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多.六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的.应对其做如下方面的鉴定:1。抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋

　　白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。2。McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体

　　进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型.如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3％)，将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多,所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:1。污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清,此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理.对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。2。融合后杂交瘤不生长:在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差,用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体.④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长,但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT。

篇六：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单

　　克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新

　　纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法.

　　一、细胞融合前准备

　　(一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0。5mlip（腹腔内注

　　射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天）1×10７／0.5mlip或iv（静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福

　　氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放

　　一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全

　　佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│（一般0。8～1ml0.2ml／点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　（ip剂量不宜超过0。5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

　　│(5~7天后采血测其效价，检测免疫效果）

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50~500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如

　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降

　　低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使

　　用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

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　　(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如:在杂交瘤细胞筛

　　选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的.常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精,消毒3~5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　↓反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20％小牛血清（NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5~8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml,小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞(3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。(三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2／0、X63Ag8。653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态,活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。（四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例

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　　较大,融合的成功率较高.脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次,置

　　平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合,选择杂交瘤（一)细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次.(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟.（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。（6)在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌.②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml,2ml，3ml,4ml，5ml和10ml。(7)离心，800rpm，6分钟。(8)弃上清,先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10ml一块96孔板。(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔,37℃、5％CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。(二）HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT.我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。50×HATH:5×10-3MA：2×10—5MT:8×10—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体.一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

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　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:1。ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2。RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3。FACS(荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测.4。IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程.可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化.犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体（特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。(一）克隆化方案用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1.有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1~5×10３／ml③取130个细胞放入6。5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2。9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml,100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。④培养4～5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时,肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法①软琼脂的配制含20%FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。0。5％琼脂:由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。②用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④1ml0.5％琼脂液（42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.

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　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃,5％CO2孵箱中。

　　⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7~10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。（二)杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液:50％小牛血清40％不完全培养液10％DMSO(二甲亚砜）冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至—70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间.五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2~4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10~20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane(降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7~10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1。抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋

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　　白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉.2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进

　　行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3％），将有利于沉淀线的形成。

　　3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护.

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外,其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长:在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长，但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致.②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好.③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”,可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞.

　　资料整理

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　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月.不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4.杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT.

　　资料整理

篇七：医防融合工作流程图

　　双手完全盖住防护口罩快速呼吸若鼻夹附近漏气若漏气位于四周若鼻夹附近漏气若漏气位于四周调整系带到不漏气为止调整系带到不漏气为止六医用防护口罩或医用外科口罩摘除流程六医用防护口罩或医用外科口罩摘除流程结束工作或需要更换口罩时结束工作或需要更换口罩时实施手卫生实施手卫生解开颈后的下方系带解开颈后的下方系带解开系于头顶中部的上方系带解开系于头顶中部的上方系带用手紧捏住口罩的系带不要接触口罩前面用手紧捏住口罩的系带不要接触口罩前面弃置于医疗废物容器中弃置于医疗废物容器中实施手卫生实施手卫生七医务人员穿隔离衣流程七医务人员穿隔离衣流程工作人员实施手卫生工作人员实施手卫生检查外包装检查效期检查外包装检查效期两手将衣领的两端向外折使内面朝向工作人员露出衣袖内口两手将衣领的两端向外折使内面朝向工作人员露出衣袖内口右手提衣领左手伸入衣袖内右手将衣领向上拉露出左手右手提衣领左手伸入衣袖内右手将衣领向上拉露出左手以同法穿另一只衣袖以同法穿另一只衣袖两手由衣领中央顺边缘向后系好颈后系带两手由衣领中央顺边缘向后系好颈后系带将隔离衣一边约在腰下5cm处渐向前拉见到边缘捏住将隔离衣一边约在腰下5cm处渐向前拉见到边缘捏住同法捏住另一侧边缘双手在背后将衣边对齐同法捏住另一侧边缘双手在背后将衣边对齐向一侧折叠一手按住折叠处另一手将腰带拉至背后折叠处向一侧折叠一手按住折叠处另一手将腰带拉至背后折叠处将腰带在背后系紧将腰带在背后系紧开始工作开始工作八医务人员脱隔离衣流程八医务人员脱隔离衣流程工作人员解开隔离衣腰带在前面打一活结工作人员解开隔离衣腰带在前面打一活结实施手卫生实施手卫生解开颈后系带解开颈后系带右手伸入左手腕部衣袖内拉下衣袖遮盖左手右手伸入左手腕部衣袖内拉下衣袖遮盖左手用遮盖着的左手握住右手隔离衣袖外面拉下右侧衣袖用遮盖着的左手握住右手隔离衣袖外面拉下右侧衣袖双手转换逐渐从衣袖内退出脱下隔离衣双手转换逐渐从衣袖内退出脱下隔离衣非一次性使用非一次性使用一次性使用一次性使用将脱下的隔离衣污染面向内卷成包裹状将脱下的隔离衣污染面向内卷成包裹状放入防渗漏污衣袋内弃置于医疗废物容器中放入防渗漏污衣袋内弃置于医疗废物容器中实施手卫生实施手卫生九医务人员穿戴医用防护服流程九医务人员穿戴医用防护服流程工作人员实施手卫生工作人员实施手卫生戴一次性工作圆帽戴一次性工作圆帽戴医用防护口罩戴医用防护口罩穿连体防护服穿连体防护服先穿下衣再穿上衣先穿下衣再穿上衣戴好连体

　　新冠肺炎医院感染防控工作流程图

　　一、新冠肺炎时期发热患者就诊流程二、六步洗手流程三、门诊和急诊预检分诊处医务人员医用防护用品穿脱流程四、医用外科口罩佩戴流程五、医用防护口罩佩戴流程六、医用防护口罩或医用外科口罩摘除流程七、医务人员穿隔离衣流程八、医务人员脱隔离衣流程九、医务人员穿戴医用防护服流程十、医务人员脱医用防护服流程十一、发热门诊医务人员穿戴防护用品流程十二、发热门诊医务人员脱防护用品流程十三、隔离区医务人员穿戴防护用品流程十四、隔离区医务人员脱防护用品流程十五、转运发热患者前工作流程十六、转运发热患者后工作流程十七、转运发热患者转运车清洁消毒工作流程十八、疑似或确诊患者出院后床单元终末清洁消毒流程十九、普通门诊接诊疑似患者后终末清洁消毒流程二十、疑似新冠肺炎患者预检分诊流程二十一、发热门诊疑似新冠肺炎患者检查流程二十二、CT室疑似新冠肺炎患者检查流程二十三、超声科疑似新冠肺炎患者检查流程二十四、心电图室疑似新冠肺炎患者检查流程二十五、疑似或确定新冠肺炎患者急诊手术管理流程二十六、疑似新冠肺炎患者口腔急诊就诊流程

　　二十七、疑似新冠肺炎患者医疗废物处置流程二十八、普通病区新冠肺炎防控制度与流程二十九、保洁人员新冠肺炎防控流程三十、临床科室疑似或确诊新冠肺炎患者使用后的可复用器械、器具和物品处置流程三十一、消毒供应中心疑似或确诊新冠肺炎患者使用后的可复用器械、器具和物品处置流程

　　一、新冠肺炎时期发热患者就诊流程

　　发热患者到院就诊

　　急诊或门诊大厅预检分诊进行分诊

　　否

　　按正常发热门诊就诊流

　　程处理

　　提供口罩，询问武汉相关暴露

　　史、接触史

　　是

　　预检分诊登记信息后，由分诊护士护送患者

　　至发热门诊

　　发热门诊登记、就诊

　　备注——新冠肺炎疑似病例需同时符合以下2条：1.流行病学史：发病前两周内有武汉市旅行史或居住史；发病前14天内曾经接触过来自武汉的发热伴有呼吸道症状的患者；有聚集性发病2.临床表现：发热；具有诊疗标准中的影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞计数减少。公共卫生科：行政值班：

　　普通病例向公共卫生科上报

　　观察病例

　　送至隔离病房

　　公共卫生科向属地疾控报告并进行网络直报，同时上报医务处

　　医院2小时内参照诊疗规范组织院内会诊

　　根据县（区）疾控部门与卫健局指示进行处理

　　二、六步洗手流程

　　在流动水下，淋湿双手。取适量洗手液，均匀涂抹至整个手掌、手背、手指和指缝。六步合计时间不少于15秒。

　　第一步（内）：掌心相对，手指并拢，相互揉搓，至少重复5-10次。（洗手掌内侧）

　　第二步（外）：手心对手背沿指缝相互揉搓，交换进行，重复5-10次。（洗手掌背面包括二三关节）

　　第三步（夹）：掌心相对，双手交叉指缝相互揉搓，至少重复5-10次。（洗指缝）

　　第四步（弓）：弯曲手指使关节在另一手掌心旋转揉搓，交换进行，至少重复5-10次。（洗指甲及手指第一关节）

　　第五步（大）：右手握住左手大拇指旋转揉搓，交换进行，至少重复5-10次（洗大拇指）。

　　第六步（立）：将五个手指尖并拢放在另一手掌心旋转揉搓，交换进行，至少重复5-10次（洗指甲尖）。

　　三、门诊和急诊预检分诊处医务人员医用防护用品穿脱流程

　　工作人员进入更衣室实施手卫生→穿工作服实施手卫生→戴工作圆帽→戴医用外科口罩穿一次性隔离衣→戴乳胶手套至预检分诊台（含预检分诊功能）开始工作

　　工作结束实施手卫生脱乳胶手套、一次性隔离衣实施手卫生摘除工作圆帽→摘除医用外科口罩→弃置于医疗废物容器中实施手卫生进入更衣室→脱去工作服实施手卫生

　　离开

　　四、医用外科口罩佩戴流程

　　实施手卫生检查医用外科口罩外包装（需在有效期内且无破损）将口罩罩住鼻、口及下巴（鼻夹向上），蓝色面朝外

　　口罩上方带系于头顶中部系紧双手食指指尖放在鼻夹上，从中间位置开始，手指向两侧移动

　　按压，根据鼻梁形状塑造鼻夹。禁用一只手捏鼻夹。由上至下展开口罩皱褶下方带系于颈后

　　双手食指指尖放在鼻夹上，从中间位置开始，手指向两侧移动按压，根据鼻梁形状塑造鼻夹。禁用一只手捏鼻夹。

　　调整系带松紧度，保持密闭性口罩潮湿后，受到患者血液、体液污染后，应及时更换

　　五、医用防护口罩佩戴流程

　　实施手卫生检查医用防护口罩外包装（需在有效期内且无破损）

　　一手托住防护口罩（有鼻夹的一面向外、向上）将防护口罩罩住鼻、口及下巴，紧贴面部用另一只手将下方系带拉过头顶，放在颈部再将上方系带拉至头顶中部

　　双手食指放在金属鼻夹上→从中间位置开始→手指两侧移动和按压→根据鼻梁形状塑造鼻夹

　　进行密合性检查【方法：双手完全盖住防护口罩快速呼吸】

　　若鼻夹附近漏气

　　若漏气位于四周调整系带到不漏气为止

　　六、医用防护口罩或医用外科口罩摘除流程

　　结束工作或需要更换口罩时实施手卫生

　　解开颈后的下方系带解开系于头顶中部的上方系带用手紧捏住口罩的系带（不要接触口罩前面）

　　弃置于医疗废物容器中实施手卫生

　　七、医务人员穿隔离衣流程

　　工作人员实施手卫生检查外包装，检查效期两手将衣领的两端向外折→使内面朝向工作人员→露出衣袖内口右手提衣领→左手伸入衣袖内→右手将衣领向上拉→露出左手

　　以同法穿另一只衣袖两手由衣领中央顺边缘向后系好颈后系带将隔离衣一边（约在腰下5cm处）渐向前拉→见到边缘捏住同法捏住另一侧边缘→双手在背后将衣边对齐向一侧折叠→一手按住折叠处→另一手将腰带拉至背后折叠处

　　将腰带在背后系紧开始工作

　　八、医务人员脱隔离衣流程

　　工作人员解开隔离衣腰带→在前面打一活结实施手卫生解开颈后系带

　　右手伸入左手腕部衣袖内→拉下衣袖→遮盖左手

　　用遮盖着的左手握住右手隔离衣袖外面→拉下右侧衣袖

　　双手转换逐渐从衣袖内退出→脱下隔离衣

　　非一次性使用

　　一次性使用

　　将脱下的隔离衣污染面向内卷成包裹状

　　放入防渗漏污衣袋内

　　弃置于医疗废物容器中

　　实施手卫生

　　九、医务人员穿戴医用防护服流程

　　工作人员实施手卫生戴一次性工作圆帽戴医用防护口罩穿连体防护服先穿下衣，再穿上衣

　　戴好连体帽，拉上拉链戴乳胶手套开始工作

　　十、医务人员脱医用防护服流程

　　实施手卫生脱连体防护服，将拉链拉到底，向上提拉衣帽，使其脱离头部

　　脱衣袖、乳胶手套污染面向里，由上向下边脱边卷

　　弃置于医疗废物容器中实施手卫生

　　摘除医用防护口罩、工作圆帽弃置于医疗废物容器中实施手卫生

　　十一、发热门诊医务人员穿戴防护用品流程

　　由员工通道进入发热门诊清洁区进入更衣室

　　实施手卫生→更换专用分体工作服→更换专用工作鞋实施手卫生→带工作圆帽→戴医用外科口罩/医用防护口罩

　　穿隔离衣→戴手套→穿鞋套进入缓冲区

　　进入污染区工作

　　十二、发热门诊医务人员脱防护用品流程

　　工作人员在污染区结束工作后在污染区实施手卫生

　　脱鞋套→实施手卫生→脱隔离衣、手套实施手卫生进入缓冲区

　　实施手卫生→摘除医用外科口罩/医用防护口罩实施手卫生摘除工作圆帽实施手卫生进入清洁区

　　更换分体工作服、工作鞋→沐浴离开

　　十三、隔离区医务人员穿戴防护用品流程

　　通过员工通道进入清洁区实施手卫生→穿分体工作服

　　实施手卫生戴一次性圆帽、医用防护口罩穿医用防护服→戴第一层乳胶手套穿隔离衣→戴第二层乳胶手套

　　戴护目镜穿靴套→鞋套二人互查，有无遗漏进入缓冲区实施手卫生进入污染区

　　十四、隔离区医务人员脱防护用品流程

　　工作结束后在污染区实施手卫生→脱鞋套实施手卫生→脱一次性隔离衣和外层手套实施手卫生→摘除护目镜→置于桶内实施手卫生→进入缓冲间实施手卫生→脱医用防护服、内层手套及靴套

　　弃置于医疗废物桶内实施手卫生→摘除医用防护口罩→弃置于医疗废物桶内中

　　实施手卫生→摘除工作圆帽→弃置于医疗废物桶内实施手卫生，进入清洁区

　　脱去工作服→沐浴→更衣→更鞋→离开清洁区

　　十五、转运发热患者前工作流程

　　工作人员实施手卫生戴工作圆帽→戴医用外科口罩（转运疑似或确诊患者时戴医用防护口罩）

　　穿戴一次性隔离衣（转运疑似/确诊患者时穿医用防护服）戴乳胶手套戴护目镜

　　指导患者佩戴医用外科口罩专用转运车→转运患者

　　十六、转运发热患者后工作流程

　　医务人员完成转运患者任务后随救护车返回指定地点更换清洁乳胶手套

　　完成救护车内设备、设施，物体表面及空气消毒手卫生

　　脱胶鞋或防渗透、耐磨鞋套实施手卫生摘除护目镜

　　脱一次性隔离衣/防护服、乳胶手套→弃置于医疗废物容器中实施手卫生

　　摘除医用外科口罩/医用防护口罩→摘除工作圆帽将产生的废弃物放置于双层黄色医疗废物袋内，采用鹅颈结式封口，分层封扎，离开科室前加套一层医疗废物袋。在封口标签和交接登记时上注明“新冠”，单独交接。

　　实施手卫生→沐浴→更衣

　　十七、转运发热患者转运车清洁消毒工作流程

　　工作人员实施手卫生戴乳胶手套

　　空气消毒30分钟后，通风

　　车内仪器设备等物体表面，使用浸有1000-2000mg/L含氯消毒液的擦拭布巾擦拭消毒

　　一块布巾只能擦拭一处

　　作用30分钟后清水擦净

　　打开车门窗通风

　　使用后擦拭布巾

　　工作人员脱去手套实施手卫生

　　浸泡于2000mg/L含氯消毒液的中

　　30分钟

　　清洗干净→干燥保存

　　十八、疑似或确诊患者出院后床单元终末清洁消毒流程

　　病室开窗通风30min后，关闭门窗，开启空气消毒器消毒或使用其他空气消毒方法，如紫外线消毒或空气消毒剂消毒

　　工作人员准备物品→实施手卫生戴工作圆帽→医用外科口罩→穿一次性隔离衣→戴乳胶手套

　　使用1000-2000mg/L含氯消毒剂布巾依次擦拭

　　擦拭呼叫器及按钮、设备带、输液架床旁桌（抽屉及夹层，桌内壁、桌面、把手及外壁）、擦

　　拭病床床头、两侧床栏、床尾板等

　　作用30min后→清水擦拭

　　使用1000-2000mg/L含氯消毒剂地巾擦拭地面

　　将用后的擦拭布巾、布巾浸泡于2000mg/L含氯消毒剂中30min

　　清洗、干燥保存

　　操作结束→依次脱去手套、脱一次性隔离衣→脱医用外科口罩、工作圆帽→弃置于医疗废物容器中→实施手卫生

　　十九、普通门诊接诊疑似患者后终末清洁消毒流程

　　开窗通风30min后，关闭门窗，开启空气消毒器消毒或使用其他空气消毒方法，如紫外线消毒或气溶胶喷雾器空气消毒

　　工作人员准备物品→实施手卫生戴工作圆帽→医用外科口罩→穿一次性隔离衣→戴乳胶手套取出使用1000-2000mg/L含氯消毒液浸泡的擦拭布巾→依次擦拭擦拭诊室物体表面：工作区域台面（电脑、桌面、刷卡机

　　等）、诊室内座椅面及靠背更换擦拭布巾

　　撤除检查床铺单→擦拭检查床垫→擦拭检查床更换擦拭布巾→擦拭诊室门把手及门面，作用30min→清水擦拭

　　取出使用1000-2000mg/L含氯消毒液浸泡的擦拭地巾→擦拭地面将用后的擦拭布巾、地巾浸泡于2000mg/L含氯消毒液内30min

　　清洗、干燥保存操作结束→依次脱去手套、脱一次性隔离衣、脱工作圆帽、脱医用外科口罩→弃置于医疗废物容器中→实施手卫生

　　二十、疑似新冠肺炎患者预检分诊流程

　　预检分诊处配备外科口罩、体温计（或体温枪）、速干手消毒剂、含氯消毒剂、75%乙醇等物品，以便随时取用

　　预检分诊处工作人员做好防护，戴一次性圆帽、一次性医用外科口罩、护目镜、一次性隔离衣、乳胶手套

　　对所有来院就诊人员进行体温检测，并注意询问患者相关流行病学接触史

　　若患者体温未超37℃，无流行病学史

　　将患者分诊至相应诊室就诊

　　若患者体温超过37℃，和/或有流行病学史者，指导其佩戴一次性医用外科口罩

　　由护士按规定路线将患者引导至发热门诊就诊并做好登记，分诊处用1000-2000mg/L含氯消毒剂或75%乙

　　醇进行擦拭消毒。

　　患者若需隔离观察，则在医护人员陪同下经专用电梯转运至二楼感染性疾病科隔离病房

　　对电梯内物体表面用1000-2000mg/L含氯消毒剂进行擦拭消毒。

　　二十一、发热门诊疑似新冠肺炎患者检查流程

　　提前通知检查科室

　　CT室：固话

　　手机

　　超声科：固话手机

　　告知检查科室患者姓名、性别、年龄和简单病情

　　使用专用电梯对患者进行转运电梯负责人：电话：

　　患者及陪护戴医用外科口罩

　　医护人员二级防护并携带转运急救箱

　　使用专用运送车送患者至检查科室，并安排至专用房间进行检查检查结束后原路返回留观室

　　根据患者行走路线，各区域按相关要求进行终末清洁消毒

　　二十二、CT室疑似新冠肺炎患者检查流程

　　固定CT五室为疑似患者进行检查

　　感染性疾病科为疑似患者开具CT检查电子申请单，患者身份证充值

　　如果接触患者身份证时，先用1000-2000mg/L含氯消毒剂进行消毒，用后更换手套，擦拭消毒刷卡器，

　　实施手卫生

　　感染性疾病科医师拨打CT室电话技师患者信息

　　，并告知

　　CT技师打印患者检查条形码，并做好个人防护，准备好1000-2000mg/L含氯消毒剂

　　为患者行CT检查（患者完全自理者陪同家属及医务人员均在机房外等候）

　　技师如果防护用品有污染应进行更换

　　检查结束后将影像资料袋交给家属或医务人员，自助机打印胶片和报告

　　CT机尽可能用75%酒精擦拭消毒，无酒精时用

　　1000-2000mg/L含氯消毒剂擦拭，作用30min后，

　　清水擦拭，以保护机器

　　机房紫外线消毒30分钟

　　1000-2000mg/L含氯消毒剂依次擦拭机房内门把手、桌面、CT机和检查床表面，作用30min后，清水擦拭

　　1000-2000mg/L含氯消毒剂擦拭地面

　　在机房内依次脱去医用防护服、手套、工作圆帽、防护口罩，实施手卫生

　　戴手套，1000-2000mg/L含氯消毒剂依次擦拭操作室桌面、电脑、键盘及周围物体表面（抹布勿滴水，以免损坏电脑）

　　用后的抹布和地巾2000mg/L含氯消毒剂浸泡30min后清洗晾干备用

　　脱去手套，实施手卫生。所有的废弃物为感染性医疗废物，套两层医疗废物包装袋，采用鹅颈结，分层封扎。在封口

　　标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋。

　　二十三、超声科疑似新冠肺炎患者检查流程

　　申请科室电话通知超声科：固话手机

　　安排到专用诊室进行检查：日间：

　　中午和夜间：

　　医师佩戴一次性医用外科口罩、帽子、一次性隔离衣、手套、套袖及护目镜

　　检查结束后，原路返回科室

　　①用75%乙醇对操作室电脑、键盘、超声机及周围物体表面进行擦拭消毒，室内门把手、桌面、检查床表面、地面等用1000-2000mg/L含氯消毒剂依次擦拭，作用30min后，清水擦拭；用后的抹布和地巾2000mg/L含氯消毒剂浸泡30min后清洗晾干备用。②从超声系统拔下探头，拆下所有可拆卸的附件，按照产品使用说明擦拭探头、连线等，探头参照高度危险性消毒采用清洁探头+高水平消毒（参照说明书）或送消毒供应中心低温灭菌＋无菌保护套/膜+无菌耦合剂

　　在室内依次脱去手套、一次性隔离衣、工作圆帽、医用外科口罩，所有的废弃物视为感染性医疗废物，套两层医疗废物包装袋，采用鹅颈结有效封口，分层封扎。在封口标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋。实施手卫生。

　　紫外线消毒30分钟，并登记

　　二十四、心电图室疑似新冠肺炎患者检查流程

　　电话（）接到疑似新冠肺炎患者检查通知

　　工作人员立即穿戴好个人防护用品：一次性医用圆帽、医用外科口罩、一次性隔离衣、护目镜、乳胶手套。

　　将患者安置于专用诊室进行检查

　　检查结束后，原路返回科室

　　用75%乙醇对操作室电脑、键盘、心电图仪等进行擦拭消毒，室内门把手、桌面、检查床表面、地面等用1000-2000mg/L含氯消毒剂依次擦拭，作用30min后，清水擦拭。

　　用后的抹布和地巾用2000mg/L含氯消毒剂浸泡30min后清洗晾干备用。

　　在室内依次脱去手套、一次性隔离衣、工作圆帽、医用外科口罩，所有的废弃物视为感染性医疗废物，套两层医疗废物包装袋，采用鹅颈结封口，分层封扎。在封口标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋。实施

　　手卫生。

　　房间紫外线消毒30分钟，并登记。

　　二十五、疑似或确诊新冠肺炎患者急诊手术管理流程

　　接急诊疑似或确诊患者手术通知

　　电话了解患者病情，询问病史、接触史，明确患者情况，纳入疑似或确诊新冠肺炎患者手术管理流程

　　转运时电梯使用联系物业负责人：

　　转运人员穿戴防护用品（一次性圆帽、医用防护口罩、护目镜、防护服、一次性鞋套、乳胶手套），使用专用推车接患者，患者戴外科口罩。

　　接到患者后二次询问病史，测量患者体温，是否有发热，查看肺部CT检查，肺部是有磨玻璃样改变（由麻醉医生或手术医生确认），患者咳嗽等症状和体征。

　　尽量减少手术间内物品，精简参加手术人员（巡回护士内外各一名）

　　医务人员防护：实行三级防护（一次性圆帽、一次性防护服、鞋套（建议使用长款）、医用防护口罩、全面型呼吸防护器或正压式头套，双层手套罩住防护服衣袖）。患者防护：非全麻者戴外科口罩，全麻者气管插管与呼吸回路间置一次性过滤器，术后对麻醉机内部进行消毒处理。

　　手术期间，关闭缓冲间，手术间呈现负压（-10pa以下）状态方可实施手术；在患者头面部放置负压吸引管。

　　器械处理：术后器械保湿，装入器械盒内，外置双层黄色医疗废物袋扎紧，外贴“新冠”标识，立即送消毒供应中心消毒灭菌。物品处理：选用一次性辅料及物品，使用后作为医疗废物处理。覆盖患者的棉被套双层被罩，若棉被被血液、体液、分泌物污染，直接作为医疗废物丢弃处理。

　　终末消毒：使用2000mg/L含氯消毒剂进行物表（手术间内手术床、灯、仪器设备、地面、墙壁、回风口；患者转运车等）喷洒、擦拭消毒；手术结束后空气净化60min，并及时更换回风口、排风口过滤器。

　　医疗废物处置：将产生的废弃物放置于双层黄色医疗废物袋内，采用鹅颈结式封口，分层封扎，离开手术间前加套一层医疗废物袋。在封口标签和交接登记时上注明“新冠”，单独交接。

　　做好参与手术人员医学观察：观察期间（两周）每日使用专用表格监测填写体温、呼吸等症状与体征，上报主管部门；观察期间出现异常，及时上报并就医治疗。

　　二十六、疑似新冠肺炎患者口腔急诊就诊流程

　　急诊疑似患者到口腔科就诊

　　工作人员穿戴好个人防护用品：一次性医用圆帽、一次性医用防护口罩、防护目镜、防护服、一次性隔离衣、乳胶手套

　　日间：夜间：

　　诊疗结束后，原路返回科室

　　用75%乙醇对检查仪器进行擦拭消毒。环境、地面等用1000-2000mg/L含氯消毒剂依次擦拭，作用30min后，清水擦拭；用后的抹布和地巾2000mg/L含氯消毒剂浸泡30min后清洗晾干备用。

　　在室内依次脱去手套、一次性隔离衣、工作圆帽、医用外科口罩，弃于医疗废物桶内（套两层医疗废物包装袋，在封口标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋），实施手卫生。

　　房间紫外线消毒30分钟，并登记。

　　二十七、疑似新冠肺炎患者医疗废物处置流程

　　产生科室

　　物业运送人员

　　暂存地人员

　　分类：诊疗新型冠状病毒肺炎患者及疑似患者发热门诊、病区、医技科室等产生的废弃物，包括医疗废物和生活

　　垃圾，均应当按照医疗废物进行分类收集。

　　含病原体的标本和相关保存液等高危险废物在产生地点进行压力蒸汽灭菌或者化学消毒处理后按照感染性废物收集

　　包装：使用双层包装袋盛装医疗废物，采用鹅颈结有效系（紧系法见下图），分层封扎。包装袋和利器盒的外表面被感染性废物污染时，增加一层包装袋。

　　标签与登记：每个包装袋、利器盒贴好中文标签（产生科室、日期、类别），并在标签和登记时标注“新冠”。

　　分区域处理：收治新型冠状病毒肺炎患者及疑似患者发热门诊和病区（房）的潜在污染区和污染区产生的医疗废物，在离开污染区前在包装袋外面再加套一层医疗废物包装袋；清洁区产生的医疗废物按照常规的医疗废物处置。

　　转运：转运人员做好个人防护，检查标识及包装完整性，交接登记注明“新冠”。每天运送结束后，对运送工具进行清洁和消毒，含氯消毒液浓度为1000-2000mg/L；运送工具被感染性医疗废物污染时，及时消毒处理。

　　暂存：宜在暂存处单独设置区域存放，尽快交由云水腾跃公司进行处置。每天两次用1000-2000mg/L的含氯消毒液对医疗废物暂存处地面进行消毒。

　　转移登记：严格执行危险废物转移联单管理，特别注明“新冠”，登记资料保存3年。

　　医疗废物袋鹅颈式封扎方法

　　医疗废物专用桶

　　内容物3/4满时封扎.步骤一：扭转袋口

　　步骤二：牢固扭转后对折

　　步骤三：紧握已扭转部位

　　步骤四：封扎带套在医疗废物袋反折下位

　　步骤五：封扎带拉紧形成有效密封

　　封扎后的医疗废物袋——“鹅颈结”

　　二十八、普通病区新冠肺炎防控制度与流程

　　一、病区内发现疑似和确诊患者，启动相关应急预案和工作流程，及时转诊到有隔离和救治能力的定点医院。等候转诊期间对患者采取及时有效的隔离与救治措施。

　　二、隔离防护措施：1、将隔离患者活动限制在隔离区域内，若确需离开时，佩戴医用外科口罩。2、对疑似或确诊患者宜专人诊疗与护理，限制无关人员出入，谢绝探视。3、在实施标准预防的基础上，采取接触隔离、飞沫隔离和空气隔离等措施。医务人员进出隔离病房，正确选用防护用品，严格按流程要求穿脱防护用品做好手卫生。4、用于诊疗疑似和确诊患者的听诊器、体温计、血压计等医疗器具及护理物品专人专用，并做好消毒工作。5、做好环境与物体表面（日常、污点与强化）清洁与消毒，加强通风与空气消毒。三、患者转运：转运工作人员实施手卫生，穿戴防护用品（一次性圆帽、医用防护口罩、护目镜、防护服、一次性鞋套、乳胶手套），使用专用推车接患者，患者戴外科口罩。四、患者转出后，按《医疗机构消毒技术规范》对其接触环境及空气进行终末消毒。1.空气：开启空气消毒器消毒或使用其他空气消毒方法，如紫外线消毒或空气消毒剂消毒，操作方法、注意事项等遵循产品的使用说明，作用30min。2.物体表面等：诊疗设施、设备表面以及高频接触表面，如床栏、床边桌、呼叫按钮、监护仪、微泵、门把手、计算机等物体表面、转运车辆、担架等运输工具（使用完之后立即消毒）首选1000～2000mg/L含氯消毒液擦拭消毒，不耐腐蚀的仪器表面、听诊器、温度计、血压计等使用75%的乙醇擦拭消毒。有肉眼可见污染物时先使用一次性吸水材料清除污染物，然后1000～2000mg/L含氯消毒液消毒。清理的污染物按医疗废物集中处置。作用30min，清水擦拭。3.地面：用1000～2000mg/L的含氯消毒液浸泡后的地巾擦拭消毒地面，作用30min。用后的地巾、布巾浸泡于1000～2000mg/L的含氯消毒液内清洗干燥保存。4.织物：尽量选用一次性织物。疑似或确诊病人用过的床单、被套、枕套、棉絮等尽量按照医疗废物处理。如需重复使用，用两层橘红色布类收集袋收集，避免产生气溶胶，分层封扎，在封口标签处标注“新冠”。送洗衣公司专机消毒（流通蒸汽/煮沸消毒30min或500mg/L含氯消毒剂浸泡消毒30min），然后常规清洗。

　　五、医疗废物管理：所有的废弃物视为感染性医疗废物，套两层医疗废物包装袋，采用鹅颈结封闭封口，分层封扎，在封口标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋。

　　发现疑似或确诊患者，启动应急预案和工作流程，及时转诊到定点医院

　　等候转诊期间对患者采取及时有效的隔离与救治措施

　　①将患者活动限制在隔离区域内，若确需离开时，佩戴医用外科口罩。②宜专人诊疗与护理，限制无关人员出入，谢绝探视。③医务人员防护：在实施标准预防的基础上，采取接触隔离、飞沫隔离和空气隔离等措施。进出隔离病房，正确选用防护用品，按流程穿脱，做好手卫生。④用于诊疗患者的听诊器、体温计、血压计等医疗器具及护理物品专人专用，并做好消毒工作。⑤做好环境与物体表面（日常、污点与强化）清洁与消毒，加强通风与空气消毒。

　　患者转运转运工作人员实施手卫生，穿戴防护用品（一次性圆帽、医用防护口罩、护目镜、防护服、一次性鞋套、乳胶手套），使用专用推车接患者，患者戴外科口罩。

　　患者转出后的终末消毒

　　1.空气：开启空气消毒器消毒或使紫外线消毒，作用30min。2.物体表面等：诊疗设施、设备表面以及高频接触表面，如床栏、床边桌、呼叫按钮、监护仪、微泵、门把手、计算机等物体表面、转运车辆、担架等运输工具（使用完之后立即消毒）首选1000～2000mg/L含氯消毒液擦拭消毒，不耐腐蚀的仪器表面、听诊器、温度计、血压计等使用75%的乙醇擦拭消毒，作用30min后，清水擦拭。3、地面：用1000～2000mg/L的含氯消毒液浸泡后的地巾擦拭消毒地面，作用30min。用后的地巾、布巾浸泡于1000～2000mg/L的含氯消毒液内清洗干燥保存。4.织物：尽量选用一次性织物。疑似或确诊患者用过的床单、被套、枕套、棉絮等用两层橘红色布类收集袋收集，避免产生气溶胶，分层封扎，在封口标签处标注“新冠”，尽量按照医疗废物处理。如需重复使用送洗衣公司专机清洗、消毒。

　　医疗废物管理：所有的废弃物视为感染性医疗废物，套两层医疗废物包装袋，采用鹅颈结封闭封口，分层封扎。在封口标签特别说明处和交接登记时标注“新冠”，转运时加套一层黄色医疗废物袋。

　　二十九、保洁人员新冠肺炎防控流程

　　做好个人防护：戴口罩、勤洗手，必要时戴一次性橡胶手套，摘手套后手卫生

　　空气通风：公共区域注意开窗通风，每日通风至少2次，保持空气流通。（电梯无人员乘坐时，注意箱体通风）做好记录

　　①地面（电梯轿厢）、墙壁、门窗、厕所消毒：用500mg/L含氯消毒剂溶液擦拭消毒或喷雾消毒，作用时间不少于30分钟，每日2次。

　　②高频接触物体表面（门把手、桌椅、楼梯扶手、水龙头、饮水机把手、厕所洗手台面、电梯按键和扶手等）：用500mg/L含氯消毒剂溶液擦拭或浸泡消毒，作用30分钟后用清水擦拭干净，每日2次。

　　③运输工具使用后用500mg/L含氯消毒液擦拭消毒，作用30分钟。④标本运送箱内外表面或空间用1000mg/L含氯消毒液可喷洒或擦拭消毒。

　　作用30分钟。⑤污点清洁与消毒：若被病人的血液、排泄物、分泌物、呕吐物等污染：

　　先用纸巾或一次性抹布去除污染物，然后使用2000mg/L含氯消毒剂擦拭消毒。（注：发热门诊日常清洁与消毒使用1000mg/L含氯消毒剂）。

　　终末消毒

　　①疑似或者确诊患者转出后进行终末消毒（使用1000-2000mg/L含氯消毒剂。）②如遇有高度疑似或确诊病例乘坐电梯时，将使用后电梯停于顶层、停止运行，

　　同时对轿厢进行彻底终末消毒，用1000-2000mg/L含氯消毒剂对物体表面进行擦拭消毒，并打开舱门通风至少1小时。

　　医疗废物：用后的手套、口罩放入医疗废物桶，按照医疗废物统一收集、处理。处理疑似新冠患者废弃物时按“新冠医废处置流程”（流程28）。

　　三十、临床科室疑似或确诊新冠肺炎患者使用后的可复用器械、器具和物品处置流程

　　病房及门诊科室

　　重复使用的灭菌诊疗器械、器具，使用后套双层医疗废物包装袋扎紧，分层封扎，每层包装均使用1000mg/l含氯消毒液喷洒消毒，粘贴标签特别标注“新冠”。转运时加套一层黄色医疗废物袋。

　　电话通知消毒供应中心值班手机，进行单独密封回收。

　　手术室

　　手术后器械保湿，装入器械盒内，外置双层黄色医疗废物袋扎紧，每层包装均使用1000mg/l含氯消毒液喷洒消毒，外贴“新冠”标识

　　电话通知消毒供应中心值班手机，立即送消毒供应中心消毒灭菌。

　　三十一、消毒供应中心疑似或确诊新冠肺炎患者使用后的可复用器械、器具和物品处置流程

　　接到临床科室疑似或确诊新冠肺炎患者使用后器械物品回收通知

　　工作人员在去污区缓冲间依次穿戴好个人防护用品：换专用拖鞋、穿鞋套、洗手后戴一次性医用圆帽、医用外科口罩、戴护目镜、

　　穿一次性防渗透隔离衣、戴手套。

　　进入去污区，戴一层乳胶手套不清点、不拆卸

　　耐高温器械、物品：采用减压沸腾清洗消毒器（包括硬质容器盒）清洗不耐高温器械、物品：采用低温物品专用清洗消毒器清洗

　　按常规器械进行清点、拆卸，清洗消毒器清洗消毒

　　器械、物品进入包装区

　　去污区人员更换外层乳胶手套后，进行环境与物体表面清洁消毒

　　物体表面、转运车、地面：用1000-2000mg/L含氯消毒液对进行擦拭或喷洒消毒，作用30分钟；空气：用1000-2000mg/L含氯消毒液喷壶进行喷雾消毒用后的抹布和地巾用1000-2000mg/L含氯消毒液浸泡30分钟清洗晾干。

　　依次脱去手套、护目镜、工作圆帽、隔离衣、鞋套，严格实施手卫生

　　所有废弃物弃于医疗废物桶内（套两层医疗废物袋，采用鹅颈结式封口，分层封扎，在封口标签和交接登记时标注“新冠”，单独交接。离开CSSD时加套一层黄色医疗废物袋）。

篇八：医防融合工作流程图

　　四医防融合核心竞争力提高核心竞争力的提高离不开优秀的人才队伍培养扎实的基础设施建设和合理的绩效分配试点工作开展以来我中心共引进一批预防医学临床医学护理等相关专业人员充实了医防融合管理队伍同时选派骨干成员参加各级医疗主管部门或医疗卫生机构组织的慢病管理培训

　　2019年医防融合工作总结(流程图)

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　　***社区卫生服务中心2019年医防融合工作总结

　　自医防融合试点工作开展以来，我中心根据上级主管部门相关部署及任务目标要求，依托紧密型医联体内资源优势，优化医防融合服务细节，积极探索医防融合服务模式，取得了一定成果，培养了一批服务队伍，也发现了一些不足，现汇报如下：

　　一、医防融合总体工作指标提升截至2019年11月底，在管高血压、糖尿病病人就诊率分别提升至**%、**%，门诊就诊的高血压、糖尿病病人管理率提升至**%、**%；二、医防融合运作模式有效探索我中心与**医院构建了紧密型医联体，每周有内分泌科等科室专家定期在中心坐诊，依托此优势资源，将**作为医疗服务主体和医疗技术支撑，我中心作为持续管理者协调患者饮食、运动行为规范和就诊途径。三、慢病高危人群筛查力度加大由于我中心服务区域居民区拆迁较多，且暂无还建，服务人群大规模减。在此基础上，我中心采取精兵策略，深挖现有服务区域，精准筛选慢病高危人群，对慢病患者早发现、早治疗，提升患者预期生活质量，并结合现代化信息手段和健康武汉App家庭医生签约服务，完善高危人群数据库，为提高管理率和规范管理率做好基础保障。

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　　四、医防融合核心竞争力提高核心竞争力的提高离不开优秀的人才队伍培养、扎实的基础设施建设和合理的绩效分配，试点工作开展以来，我中心共引进一批预防医学、临床医学、护理等相关专业人员，充实了医防融合管理队伍，同时选派骨干成员参加各级医疗主管部门或医疗卫生机构组织的慢病管理培训；扩充了中心慢性病用药目录，结合公共卫生管理系统和中心HIS系统等信息化手段，搭建慢病管理团队与药品采购部门沟通平台，根据患者用药需求及时提供药品供应。五、目前存在的不足（一）慢病管理能力仍需提升，目前慢病发病趋势朝着年轻化、并发症多样化发展，管理难度进一步提升，对我们基层医疗卫生机构的管理提出了很大挑战，我中心医防融合管理团队在这些方面缺乏相应的技术储备，需要在今后继续学习，补齐短板。（二）绩效分配手段激励性不够目前我中心绩效正在准备新一轮的绩效分配制度改革，但是总体框架仍在传统的公共卫生服务和全科医疗范围内单独进行，需要在新的绩效分配方案实施后，根据中心职工工作情况反馈，针对医防融合工作做出专项激励措施。

　　**社区卫生服务中心2019年12月17日

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　　附：医防融合工作流程图

　　辖区服务人群

　　全科门诊筛查

　　健康讲座，社区巡诊筛查

　　慢病确诊人群慢病管理

　　无效

　　慢病高危人群健康管理

　　生理指标正常

　　生理指标异常

　　管理团队反馈至全科门诊或医联体专制定个体家化治疗方案

　　有效健康人群

　　生理指标异常

　　转诊至上级医联体单位

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篇九：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖,从而创立了单

　　克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新

　　纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案：

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)

　　↓2~3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0.5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天）1×10７／0。5mlip或iv（静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂,福氏

　　不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一

　　滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐

　　剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀.

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│（一般0。8~1ml0.2ml／点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　（ip剂量不宜超过0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip

　　│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50~500μg为宜,ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,

　　如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可

　　降低抗原的使用量.②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使

　　用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　（二)饲养细胞

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　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系,常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6~8ml培养液

　　↓反复冲洗,吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管,1200转／分离心5~6分钟

　　↓用20％小牛血清(NCS）或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105／ml,均为100μl／孔。（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8。653等.骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基.小牛血清的浓度一般在10~20％，细胞的最大密度不得超10６／ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性,每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤）筛选一次,以防止细胞的突变.保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。（四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次,置平

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　　皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍,细胞数为２×10８左右.二、细胞融合，选择杂交瘤（一)细胞融合流程

　　(1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次.

　　(2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。（3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。（5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。（6）在室温下融合:①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO,边加边搅拌.②作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟。③加预热的不完全培养液，终止PEG作用,每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml,5ml和10ml。（7)离心，800rpm，6分钟。（8）弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开.（9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。（10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。(二)HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度.一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中.因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择,可得到满意的筛选结果。50×HATH：5×10-3MA：2×10—5MT：8×10—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液,再维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体.一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

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　　常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2。RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测.3。FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测.上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞.要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化.克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法.1。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1~5×10３／ml③取130个细胞放入6。5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加2。2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个／ml，100μl／孔,加G、H两排,为每孔0。5个细胞。④培养4~5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时,肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测.注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2。软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热.0.5％琼脂:由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温.②用上述0。5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml,500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④1ml0。5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃,5％CO2孵箱中。

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　　⑥4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体,扩大培养，必要时再克隆化。（二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液：50％小牛血清40％不完全培养液10％DMSO（二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至—70℃可放入液氮中.或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间.五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体.但此方法产量低，一般培养液含量为10~60μg／ml,如果大量生产,费用较高.2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml.但采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7~10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml,这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多.六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1。抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb,除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应,其次是与其它细胞因子间有无交叉.

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　　2.McAb的Ig类与亚类的鉴定:一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型.如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM,则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类.在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%)，将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护.

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点,来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5.McAb亲和力的鉴定:用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长,环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:1。污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之,以免污染整个培养环境.支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染.在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染.2。融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长.②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选.③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要"“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施.三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管.要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长"。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　资料整理

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　　4。杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

　　资料整理

篇十：医防融合工作流程图

　　单抗制备流程

　　1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.

　　1。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案：

　　射）

　　初次免疫

　　1×10７／0。5mlip（腹腔内注

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0.5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天）1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2。可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

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　　│（一般0。8～1ml0。2ml／点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip

　　│(5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）

　　↓2~3周后

　　加强免疫,剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量.②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　（二）饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓

　　拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　资料整理

　　↓

　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓

　　用无菌注射器注入6~8ml培养液

　　↓

　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓

　　放入10ml离心管,1200转／分离心5～6分钟

　　↓

　　用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓

　　加入96孔板,100μl／孔

　　↓

　　放入37℃CO2孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备,一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml,小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞(3T3）1×105／ml，均为100μl／孔.

　　(三)骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb.

　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时,上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细

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　　胞.

　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性,每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次,以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

　　(四）免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高.

　　脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右.

　　二、细胞融合,选择杂交瘤

　　（一）细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0,1000rpm离心5分钟,弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次.

　　（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

　　（4)弃上清,用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

　　（5）轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动.

　　(6)在室温下融合：

　　①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml,4ml,5ml和10ml。

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　　(7)离心，800rpm，6分钟。

　　(8)弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开.

　　（9)根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养.

　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞.

　　(二）HAT选择杂交瘤

　　应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到,这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200μl／孔.所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

　　50×HAT

　　H：5×10—3M

　　A:2×10-5M

　　T：8×10—4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

　　三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系.

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

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　　常用的方法有:

　　1。ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测.

　　2。RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

　　3.FACS(荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4。IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机.

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存

　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失.即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

　　(一）克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法.

　　1。有限稀释法的程序

　　①制备饲养细胞悬液（同融合前准备)

　　②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

　　③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加2。2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0。5个细胞。

　　④培养4～5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

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　　⑤第8～9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。

　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2.软琼脂法

　　①软琼脂的配制

　　含20%FCS(小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640

　　1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

　　0。5％琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　②用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液.

　　④1ml0。5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.

　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃,5%CO2孵箱中。

　　⑥4~5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化.

　　(二）杂交瘤细胞的冻存

　　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液：

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　　50％小牛血清

　　40％不完全培养液

　　10％DMSO（二甲亚砜）

　　冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速.冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2~3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

　　五、单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:

　　1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。

　　2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml，共2~4点.待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限。

　　②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前,处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

　　六、单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

　　1。抗体特异性的鉴定:除用免疫原（抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外,还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应,以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

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　　2。McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型.如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定:用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护.

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同.

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

　　七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长,环节多，所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：

　　1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染.在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理.对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染.

　　2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足.

　　3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①融合后有细胞生长,但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致.

　　②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好.

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　　③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失.Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况.要定期进行再克隆.三不要:不要让细胞“过度生长"。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代.4。杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT。

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篇十一：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　（一)免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.

　　1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip（腹腔内注

　　射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5mlip或iv（静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

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　　│(一般0.8～1ml0.2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

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　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip

　　│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射.③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性.

　　(二）饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞,如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6~10周龄

　　↓

　　拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3~5分钟

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　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

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　　用无菌注射器注入6～8ml培养液

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　　反复冲洗，吸出冲洗液

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　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

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　　用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清(FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

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　　加入96孔板，100μl／孔

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　　放入37℃CO2孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。

　　（三)骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

　　常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2／0、X63Ag8.653等.

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次.细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

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　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞,为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。

　　(四)免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍,细胞数为２×10８左右。

　　二、细胞融合，选择杂交瘤

　　(一）细胞融合流程

　　（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0,1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　（3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟.

　　(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度.

　　（5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　(6)在室温下融合：

　　①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml,3ml，4ml，5ml和10ml。

　　（7）离心，800rpm,6分钟。

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　　(8)弃上清,先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开.

　　(9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　(10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5%CO2孵箱培养。

　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞.

　　（二）HAT选择杂交瘤

　　应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存,用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞,200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

　　50×HAT

　　H:5×10—3M

　　A:2×10—5M

　　T:8×10—4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液.

　　三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有：

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　　1。ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测.

　　3。FACS（荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4。IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存

　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力.

　　（一)克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1.有限稀释法的程序

　　①制备饲养细胞悬液(同融合前准备）

　　②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

　　③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml,100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0。5个细胞。

　　④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl／孔。

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　　⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2。软琼脂法

　　①软琼脂的配制

　　含20％FCS(小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640

　　1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

　　0.5％琼脂：由1份1%琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　②用上述0。5％琼脂液（含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　③按100／ml,500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　④1ml0.5％琼脂液（42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.

　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃，5%CO2孵箱中。

　　⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

　　（二）杂交瘤细胞的冻存

　　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液：

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　　50％小牛血清

　　40％不完全培养液

　　10％DMSO(二甲亚砜）

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至—70℃可放入液氮中.或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

　　五、单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

　　1。体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。

　　2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限。

　　②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane（降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠,1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次.腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多.

　　六、单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

　　1.抗体特异性的鉴定:除用免疫原(抗原）进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验,方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

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　　2。McAb的Ig类与亚类的鉴定:一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG(3%)，将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力.

　　七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:

　　1。污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境.支原体的污染主要来源于牛血清，此外,其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

　　2。融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体.④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足.

　　3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①融合后有细胞生长，但无抗体产生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

　　②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

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　　③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长.也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

　　要定期进行再克隆。

　　三不要:

　　不要让细胞“过度生长”.因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势,压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代.

　　4.杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关,或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功.若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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篇十二：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一)免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip(腹腔注射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0.5mlip

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　　word

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(静脉注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│(一般0.8～1ml0.2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

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　　word第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

　　│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　(二)饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

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　　word小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射器注入6～8ml培养液↓反复冲洗，吸出冲洗液↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟↓用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1

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　　×10５／ml

　　word

　　↓

　　加入96孔板，100μl／孔

　　↓

　　放入37℃CO2孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。

　　(三)骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔产生大量McAb。

　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

　　5/16

　　word

　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。

　　(四)免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

　　二、细胞融合，选择杂交瘤

　　(一)细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

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　　word(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

　　(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　(6)在室温下融合:

　　①30秒加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

篇十三：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

　　单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

　　新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　（一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要.一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定。

　　1。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip（腹腔内注

　　射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫（融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂,福氏

　　不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一

　　滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐

　　剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│(一般0.8～1ml0.2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

　　│(5~7天后采血测其效价，检测免疫效果）

　　↓2~3周后

　　加强免疫,剂量50～500μg为宜,ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如

　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降

　　低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射.③使

　　用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性.

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　　(二）饲养细胞在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛

　　选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏.

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　↓反复冲洗,吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20％小牛血清(NCS）或胎牛血清（FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb.常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8。653等。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态,活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。（四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例

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　　较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置

　　平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合,选择杂交瘤（一)细胞融合流程

　　(1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次.（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟.（4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6)在室温下融合:①30秒内加入预热的1ml45%PEG(Merek，分子量4000）含5%DMSO,边加边搅拌。②作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟.③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml,2ml,3ml，4ml，5ml和10ml。（7)离心，800rpm，6分钟。（8）弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。（9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。（10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养.一般一块96孔板含有1×107脾细胞。（二)HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到,这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中.因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔.所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果.50×HATH:5×10—3MA：2×10—5MT:8×10—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液,再维持培养两周，改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

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　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则.

　　常用的方法有:1。ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3。FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失.即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1.有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1~5×10３／ml③取130个细胞放入6。5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml,100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml,100μl／孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2。2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排,为每孔0。5个细胞。④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测.注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2。软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS(小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。②用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液.④1ml0。5％琼脂液（42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

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　　⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　　⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦检测抗体，扩大培养,必要时再克隆化。(二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等.如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液:50％小牛血清40%不完全培养液10％DMSO(二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中.也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。2。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml，共2~4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天）则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限.②腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7～10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1~10ml腹水.也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的.应对其做如下方面的鉴定:1.抗体特异性的鉴定:除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗

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　　体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

　　2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成.

　　3。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护.

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力.七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：1。污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境.支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查,查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体.④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足.3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好.③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长.也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要"，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况.要定期进行再克隆。三不要：不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

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　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代.4。杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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篇十四：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　19７5年，Ｋｏｈｌer和Milｓtein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细

　　胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，

　　从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础

　　研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的ＭcＡb至关

　　重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据

　　抗原的特性不同而定。

　　1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性

　　抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×107/0.5mlｉp（腹腔内注射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７/0。５mlip

　　↓3周后

　　加强免疫（融合前三天）１×１07/0。5mlip或iv（静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂,福氏不

　　完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一滴在

　　水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态．商品化福氏完全佐剂在

　　使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀.

　　初次免疫Ag1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│（一般0.８～１ml0。2mｌ/点）

　　↓３周后

　　第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ｉp

　　│

　　(ip剂量不宜超过０．5ｍl)

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ｉp

　　│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）

　　↓2~3周后

　　加强免疫,剂量50～５０0μg为宜，ip或ｉv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新,

　　如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可

　　降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射．③

　　使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　(二）饲养细胞

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　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BａLb/ｃ小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于7５％酒精，消毒３~5分钟↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓

　　用无菌注射器注入6～8ｍl培养液↓反复冲洗,吸出冲洗液↓放入１0ml离心管,1200转／分离心5～6分钟↓用20%小牛血清(NCS）或胎牛血清（FＣS）的培养液混悬，调整细胞数1×１05/ml

　　↓加入９6孔板，１00μｌ/孔

　　↓放入３7℃CＯ２孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×１06腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为５×106／ml,小鼠脾细胞为1×１06/ml，小鼠的成纤维细胞（3Ｔ３）１×105/mｌ,均为10０μｌ／孔．(三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McＡb。常用骨髓瘤细胞系有：ＮＳ1、ＳP２/０、X6３Ag8。6５３等．骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1６40，ＤＭEM培养基。小牛血清的浓度一般在10~20%,细胞的最大密度不得超106/ｍl，一般扩大培养以1∶1０稀释传代,每３～５天传代一次.细胞的倍增时间为16~20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞.一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对ＨAＴ的敏感性，每3～6月应用8～AＧ(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次,以防止细胞的突变．保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态，活细胞计数高于9５％，也是决定细胞融合的关键。（四）免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大,融合的成功率较高.脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏,用不完全的培养液洗一次,置平

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　　皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×1０８左右.二、细胞融合，选择杂交瘤（一)细胞融合流程

　　（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP２／０，1００0ｒpｍ离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或１∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗１次,１200rpm,8分钟。（4）弃上清,用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。（5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。（6）在室温下融合:①3０秒内加入预热的１ml45%PEＧ(Merｅｋ，分子量4０００)含5％DMSO,边加边搅拌.②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至12０秒钟。

　　③加预热的不完全培养液,终止ＰEＧ作用,每隔２分钟分别加入1ml，2ml,3ml,４ml，5ml和１0ml。

　　（7）离心,800rpm，6分钟。（8）弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打,以免使融合在一起的细胞散开。（9）根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10mｌ一块９6孔板。(1０）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，1０0μl/孔,37℃、5％ＣＯ2孵箱培养。一般一块９6孔板含有1×10７脾细胞。（二)ＨAT选择杂交瘤

　　应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后，加ＨAT选择培养液.HT和HＡT均有商品化试剂５0×贮存,用时1ml加入５0ｍl20%小牛血清完全培养液中.

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，2０0μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为,融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果.

　　５0×ＨＡTＨ：5×10—3M

　　Ａ:2×10—5MT:8×１0—4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后,改用ＨＴ培养液,再维持培养两周,改用一般培养液.三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时,即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系.

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，

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　　一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则.常用的方法有：1。ELIＳA用于可溶性抗原（蛋白质)、细胞和病毒等McＡb的检测。2。RIA用于可溶性抗原、细胞McＡb的检测。3.FACS（荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的ＭcAb检测。４。IFA用于细胞和病毒ＭｃAb的检测.上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤

　　克隆不能保证一个孔内只有一个克隆.在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化.克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失.即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液(同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～５×１03／mｌ③取１３0个细胞放入6.５ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞／ml，

　　100μl/孔加A、B、Ｃ三排为每孔2个细胞.余下２.9ml细胞悬液补加2。9mｌ含饲养细胞的完全培养液,细胞数为１0个／ml，１０0μl／孔加D、E、Ｆ三排,为每孔1个细胞。余下2。2mｌ细胞悬液补加2．２ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μｌ/孔,加G、Ｈ两排，为每孔0。5个细胞。

　　④培养４～5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μｌ／孔.

　　⑤第８～9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测.注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HＴ。2.软琼脂法①软琼脂的配制含20%FＣS(小牛血清）的2倍浓缩的ＲＰMI16401％琼脂水溶液:高压灭菌，42℃预热。0。5％琼脂:由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的ＲPＭＩ1６40配制而成。置42℃保温。②用上述０．5％琼脂液(含有饲养细胞)１5ml倾注于直径为9ｃm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100/ml,500／ml或50００／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④１mｌ0.5％琼脂液(4２℃预热)在室温中分别与1mｌ不同浓度的细胞悬液相混合。⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于3

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　　７℃,5%CO2孵箱中。⑥4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后，直接移种至含饲养细胞的

　　24孔板中进行培养。⑦检测抗体,扩大培养，必要时再克隆化.(二)杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要

　　的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃.

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿.

　　细胞冻存液:5０％小牛血清40％不完全培养液1０％DMSO(二甲亚砜）冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温２～3℃,待降至—70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间.五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～6０μg/ｍl，如果大量生产，费用较高。２．体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×1０7／ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0。2mｌ，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10~２0天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml.但采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射0。５mlPrｉｓtanｅ(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7~１0天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~1０ｍl腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-２０mg/ｍl,这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的MｃAｂ进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：１．抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外,还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ＥLISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的ＭcＡb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋

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　　白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉.2．ＭcＡb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗

　　体进行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ｉg类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgＭ，则检测出来的抗体一般是IｇG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ＥLISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PＥG(3%），将有利于沉淀线的形成.

　　３。McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McＡb的生物学活性。例如如果确定抗病毒MｃAb的中和活性,则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护.

　　4.ＭｃAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合试验、测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原位点，来确定ＭｃAb的识别的表位是否相同．

　　５.ＭｃAb亲和力的鉴定:用ＥLIＳＡ或ＲIＡ竞争结合试验来确定ＭcAb与相应抗原结合的亲和力.七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备ＭcＡｂ的实验周期长，环节多,所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:1．污染:包括细菌、霉菌和支原体的污染.这是杂交瘤工作中最辣手的问题.一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清,此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／ｃ小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞,一般可除去支原体污染。2.融合后杂交瘤不生长:在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEＧ有毒性或作用时间过长.②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选.③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HＡＴ有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAＴ中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失.Gｏding9１9８2)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管.要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况.要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞.不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月.

　　资料整理

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　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4．杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污

　　染，使克隆化难以成功.若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HＴ。

　　资料整理

篇十五：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

　　单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

　　新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法.

　　一、细胞融合前准备

　　（一）免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定.

　　1。颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞

　　性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫

　　1×10７／0。5mlip（腹腔内注

　　射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0.5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天)1×10７／0。5mlip或iv(静脉内注射）

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏

　　不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一

　　滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐

　　剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│（一般0。8～1ml0.2ml／点）

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　（ip剂量不宜超过0。5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip

　　│（5~7天后采血测其效价,检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50~500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新,如

　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降

　　低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射.③使用

　　细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

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　　(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛

　　选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏.

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6~10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精,消毒3~5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　↓反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管,1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5~8×106腹腔巨噬细胞,若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。（三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb.常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8。653等.骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3～5天传代一次.细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞.一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态,活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键.(四）免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大,融合的成功率较高。

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　　脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。二、细胞融合,选择杂交瘤（一）细胞融合流程

　　(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次。

　　(2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。（3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟。（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6）在室温下融合:①30秒内加入预热的1ml45%PEG（Merek,分子量4000）含5%DMSO，边加边搅拌。②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml.（7)离心，800rpm,6分钟.（8)弃上清,先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬,切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开.（9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。(10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5%CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞.（二）HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后,加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT.我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。50×HATH：5×10—3MA：2×10-5MT:8×10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液,再维持培养两周,改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体.一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,

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　　一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则.常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。2。RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。3。FACS(荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测.4。IFA用于细胞和病毒McAb的检测.上述方法均为一般实验室的常规方法,故在此不介绍具体的实验过程.可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机.

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化.犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤

　　克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化.克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

　　（一）克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。1。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml③取130个细胞放入6。5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml,100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞.余下2。9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个／ml,100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞.余下2.2ml细胞悬液补加2。2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排,为每孔0。5个细胞.④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时,肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测.注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法①软琼脂的配制含20%FCS（小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401%琼脂水溶液：高压灭菌,42℃预热。0。5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成.置42℃保温。②用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用.③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。④1ml0。5%琼脂液(42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟,使其凝固，孵育于

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　　37℃，5%CO2孵箱中。⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆,7～10天后,直接移种至含饲养细

　　胞的24孔板中进行培养。⑦检测抗体,扩大培养，必要时再克隆化。（二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的.

　　因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等.如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养，当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液：50％小牛血清40％不完全培养液10%DMSO（二甲亚砜)冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速.冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2~3℃，待降至—70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1。体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清.①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0。2ml，共2~4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10~20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限.②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠,1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：1。抗体特异性的鉴定:除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋

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　　白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉.2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进

　　行筛选时,已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时,如加入适量的PEG（3％）,将有利于沉淀线的形成。

　　3。McAb中和活性的鉴定:用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4。McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定:用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多,稍不注意就会造成失败.

　　其主要失败原因和影响因素有：1.污染:包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境.支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理.对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔,待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2。融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足.3。杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长,但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变,变成A抵抗细胞所致.②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性,可能是细胞支原体污染,或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长,从而抑制了抗体分泌细胞的生长.也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要"，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要：要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆。三不要:不要让细胞“过度生长"。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞.不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

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　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。4。杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功.若是融合后的早期克隆化,应在培养液加HT。

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篇十六：医防融合工作流程图

P>　　2019年医防融合工作总结(流程图)

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　　***社区卫生服务中心2019年医防融合工作总结

　　自医防融合试点工作开展以来，我中心根据上级主管部门相关部署及任务目标要求，依托紧密型医联体内资源优势，优化医防融合服务细节，积极探索医防融合服务模式，取得了一定成果，培养了一批服务队伍，也发现了一些不足，现汇报如下：

　　一、医防融合总体工作指标提升截至2019年11月底，在管高血压、糖尿病病人就诊率分别提升至**%、**%，门诊就诊的高血压、糖尿病病人管理率提升至**%、**%；二、医防融合运作模式有效探索我中心与**医院构建了紧密型医联体，每周有内分泌科等科室专家定期在中心坐诊，依托此优势资源，将**作为医疗服务主体和医疗技术支撑，我中心作为持续管理者协调患者饮食、运动行为规范和就诊途径。三、慢病高危人群筛查力度加大由于我中心服务区域居民区拆迁较多，且暂无还建，服务人群大规模减。在此基础上，我中心采取精兵策略，深挖现有服务区域，精准筛选慢病高危人群，对慢病患者早发现、早治疗，提升患者预期生活质量，并结合现代化信息手段和健康武汉App家庭医生签约服务，完善高危人群数据库，为提高管理率和规范管理率做好基础保障。

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　　四、医防融合核心竞争力提高核心竞争力的提高离不开优秀的人才队伍培养、扎实的基础设施建设和合理的绩效分配，试点工作开展以来，我中心共引进一批预防医学、临床医学、护理等相关专业人员，充实了医防融合管理队伍，同时选派骨干成员参加各级医疗主管部门或医疗卫生机构组织的慢病管理培训；扩充了中心慢性病用药目录，结合公共卫生管理系统和中心HIS系统等信息化手段，搭建慢病管理团队与药品采购部门沟通平台，根据患者用药需求及时提供药品供应。五、目前存在的不足（一）慢病管理能力仍需提升，目前慢病发病趋势朝着年轻化、并发症多样化发展，管理难度进一步提升，对我们基层医疗卫生机构的管理提出了很大挑战，我中心医防融合管理团队在这些方面缺乏相应的技术储备，需要在今后继续学习，补齐短板。（二）绩效分配手段激励性不够目前我中心绩效正在准备新一轮的绩效分配制度改革，但是总体框架仍在传统的公共卫生服务和全科医疗范围内单独进行，需要在新的绩效分配方案实施后，根据中心职工工作情况反馈，针对医防融合工作做出专项激励措施。

　　**社区卫生服务中心2019年12月17日

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　　附：医防融合工作流程图

　　辖区服务人群

　　全科门诊筛查

　　健康讲座，社区巡诊筛查

　　慢病确诊人群慢病管理

　　无效

　　慢病高危人群健康管理

　　生理指标正常

　　生理指标异常

　　管理团队反馈至全科门诊或医联体专制定个体家化治疗方案

　　有效健康人群

　　生理指标异常

　　转诊至上级医联体单位

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篇十七：医防融合工作流程图

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　　单抗制备流程

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小

　　鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了

　　单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了

　　新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤

　　细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步

　　骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　（一)免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重

　　要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗

　　原的特性不同而定.

　　1。颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细

　　胞性抗原为例的免疫方案：

　　初次免疫

　　1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)

　　↓2～3周后

　　第二次免疫

　　1×10７／0。5mlip

　　↓3周后

　　加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv（静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏

　　不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一

　　滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐

　　剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│(一般0。8～1ml0。2ml／点)

　　↓3周后

　　第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│

　　（ip剂量不宜超过0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip

　　│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）

　　↓2～3周后

　　加强免疫,剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如

　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降

　　低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射.③使用

　　细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　(二)饲养细胞

　　资料整理

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　　在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6~10周龄

　　↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　↓用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜

　　↓用无菌注射器注入6~8ml培养液

　　↓反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　↓用20%小牛血清(NCS）或胎牛血清(FCS）的培养液混悬,调整细胞数1×10５／ml

　　↓加入96孔板，100μl／孔

　　↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞（3T3)1×105／ml，均为100μl／孔.(三）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8。653等.骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液,如RPMI1640，DMEM培养基.小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml,一般扩大培养以1∶10稀释传代,每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8~AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。（四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液,由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

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　　脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右.二、细胞融合，选择杂交瘤（一）细胞融合流程

　　（1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次.

　　（2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟.(4）弃上清,用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度.(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动.（6）在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek，分子量4000)含5%DMSO，边加边搅拌。②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟.③加预热的不完全培养液，终止PEG作用,每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7）离心，800rpm，6分钟。(8）弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。（9）根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液，10ml一块96孔板。(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5%CO2孵箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。（二)HAT选择杂交瘤应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。一般在融合24小时后，加HAT选择培养液.HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。50×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT：8×10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周,改用一般培养液。三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中,仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时,即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，

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　　一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测.3。FACS（荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。4。IFA用于细胞和病毒McAb的检测。上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。可靠的筛选方法必须在融合前建立,避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤

　　克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

　　(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法.1。有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液(同融合前准备）②阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×10３／ml③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排,为每孔0。5个细胞。④培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。2.软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401%琼脂水溶液：高压灭菌,42℃预热。0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。②用上述0。5%琼脂液(含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液.④1ml0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合.⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟,使其凝固，孵育于

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　　37℃，5％CO2孵箱中。⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细

　　胞的24孔板中进行培养.⑦检测抗体，扩大培养,必要时再克隆化.(二）杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要

　　的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃.

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液：50％小牛血清40%不完全培养液10％DMSO（二甲亚砜）冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至—70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃后放—70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存.冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清.①实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107／ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2ml,共2~4点.待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1—10mg／ml。但采血量有限。②腹水的制备常规是先腹腔注射0。5mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7～10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5—20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。六、单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：1。抗体特异性的鉴定:除用免疫原（抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体,应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

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　　2。McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型.如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类.至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3%），将有利于沉淀线的形成。

　　3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5。McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多,所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有：1。污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题.一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室,要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法,将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时,犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。2。融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体①融合后有细胞生长,但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致.②有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。③对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长.也可能发生染色体丢失.Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。要定期进行再克隆.三不要:不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代.

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　　4。杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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